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        細胞問題集錦
        來源:本站  發布日期:2015/12/17  點擊次數:980

        1、舒林酸和尼美舒利的溶解方法的問題:

        問:最近在做試驗時發現舒林酸和尼美舒利兩種藥物很難溶解,加入DMSO后可以溶解,但是再加入1640培養液稀釋時又出現結晶,而且很難溶解。有什么好的辦法嗎?

        答:(1)可以先把所需藥母液加如一個小安剖瓶,再加入培養基,用槍多吹打幾分鐘就會溶解。

        (2)如果還是溶解不了,可以換用乙醇試試。

        (3)配制藥母液時濃度要盡量高,這樣稀釋后培養基中的DMSO濃度才越低。

        2、細胞因子加入劑量的問題:

        問:已經知道某個細胞因子在體內正常的血清濃度為10-12IU/L,臨床常用治療劑量為100IU/kg,F在我們想研究該細胞因子對體外細胞功能的影響。如何決定細胞培養中的該細胞因子加入劑量,謝謝!并請提供原理!

        答:臨床用藥濃度和細胞培養的藥物干預濃度無法直接換算,有兩方面原因,一是臨床用藥劑量不等同于血藥濃度,即使是已知的血藥濃度,也不等同于作用于靶器官/細胞的藥物濃度。二是體外細胞學實驗是藥物作用于孤立的細胞,而細胞在體內要受到眾多因素和內環境的影響,對藥物的敏感性會有很大的不同。

        所以你的問題很難回答,常規的實驗思路是這樣的:

        (1)體外實驗,研究藥物對細胞是否有作用,如有作用,測出其量效關系和時效關系,進一步研究其作用機理。

        (2)體內實驗之前,研究一下該藥物在體內的藥代動力學,毒性等。

        (3)動物體內實驗,研究藥物作用的有效劑量給藥方式,進一步闡述其機理。

        (4)臨床實驗。

        所以對于你的問題,我的想法是,不必拘泥于同臨床用藥劑量一致性的問題。以該藥物的血清濃度為標尺(10-12IU/L),上下呈10倍藥物濃度浮動,如0.001 IU/L、0.01 IU/L、0.1 IU/L、1 IU/L、10 IU/L、100 IU/L做一次六孔板實驗,得到大致的有效濃度范圍后,按此道理再做一次六孔板實驗(倍比關系),就可以確定其作用的量效關系了。最后選定理想的作用劑量研究其對細胞具體功能的影響和機制等。

        3、細胞培養中的現象問題:

        問:現在做系膜細胞實驗,細胞復蘇后長勢良好,隔一天換液時發現培養瓶底有一層薄膜,晃動培養瓶后,有一張完整的膜脫落,培養液沒有變混濁,以為是細胞脫壁呢,去掉膜后觀查發現細胞還在,已經快長滿一瓶了,然后進行傳代,第二天觀察發現傳的六瓶細胞中有三瓶細胞中又出現了類似的膜。是為什么?

        答:我以前也碰過,我認為可能是傳的細胞太多,細胞粘連在一起,可能是死亡細胞,以前做流式的時候碰過,也有可能是消化的時候加入胰酶后放的時間太長所致。

        4、純化急性分離的成年大鼠心肌細胞及鑒別方式的問題:

        問:我用Langendorff裝置通過膠原酶好不容易分離出了成年大鼠心肌細胞,但文獻講這樣分的心肌細胞中還有很多雜細胞(成纖維,內皮細胞),我要用這批細胞做流式,需要純化并鑒別純度,我查了文章好像用了6%bsa沉降法來純化的,具體怎樣操作呢?

        答:我們用膠原酶分離下來細胞后,用200目濾網過濾,待細胞自然沉降,得長桿狀細胞就是,好像不用分離純化。

        5、問:線粒體特異性的標記物有哪些?

        答:可以用JANUS GREEN B(詹那斯綠)染,線粒體中的細胞色素氧化酶可以氧化其成藍綠色。這是活體線粒體特異性染料。你的目的是否與此有關?

        6、MTT法測細胞黏附率的問題:

        問:不少文章提到在他們使用MTT法測細胞黏附率或黏附抑制率時,將細胞種入96孔板孵育前,都預先按分組要求,將細胞與干預藥物先一起加入試管中或24孔板中孵育30min,然后再種入96孔板中孵育90min或以上,才測OD值。為什么不一次就加到96孔板中,而是先放在試管或24孔板中孵育一段時間才種96孔板呢?是要起到什么作用呢?

        答:預先讓藥物和細胞孵育,可以讓藥物充分地作用于細胞,對細胞貼壁功能有足夠的影響后再測其粘附抑制率,這樣結果比較真實。而直接將藥物和細胞一次加到96孔板中,藥物作用發揮得不會很充分。

        7、線粒體提取問題:

        問:我準備做液閃儀測心肌細胞線粒體ANT轉運酶活性檢測,想從培養所得的細胞中提取線粒體進行檢測?吹竭^一些檢測方法,但不知得率是多少,也沒有看到出處,有哪位做過,能給個提取線粒體的方案嗎?方便的話給個出處。我查到韓國的一篇文獻上有方法,但需要超聲破膜,我們這沒有破膜機器,不方便,所以想找個不用超聲破膜的方法。若提得線粒體,如何看它有沒有活性呢?用詹那綠B就可以么?另外,因為接著要用液閃儀,可是從細胞里提線粒體是不是會很少啊,液閃儀大概需要多少樣本量呢?

        答:(1)提取新鮮心肌組織細胞內線粒體的方案:心肌組織切碎后在4℃介質(0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl pH7.4、0-4℃)中制備心肌組織勻漿。勻漿經750g、離心10min后留上清,以9000g離心20min后留沉淀,重新懸浮后以9000g再離心20min,棄上清得線粒體.全部操作于4℃進行。

        (2)培養細胞提取線粒體。細胞棄去培養液后,用細胞收集液作用2到3分鐘,用scraper,將細胞收集起來,6000g,離心15分鐘。棄上清,之后加細胞勻漿液,用勻漿器或手動勻漿管勻漿,將裝有勻漿液的離心管配平后放入普通離心機,以2500rpm,離心15分鐘,緩緩取上清液,移入高速離心管中,保存于有冰塊的燒杯中。以17000rpm離心20分鐘,棄上清,留取沉淀物。加入0.25mol/L蔗糖與0.003mol/L氯化鈣液lml,用吸管吹打成懸液,以17000rpm離心20分鐘,將上清吸入另一試管中,留取沉淀物,加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖與0.003mol/L氯化鈣溶液混勻成懸液,即得線粒體。

        (3)液閃儀我沒有用過,不過我覺得提取的線粒體數目應該足夠你做(每個心肌細胞中都有>1000個的線粒體)。具體的上樣標準我覺得需要查你使用的液閃儀的說明書。

        8、問:鹽酸乙醇該怎么配置呢?

        答:在丁香園里搜索“鹽酸乙醇”,有很多配制的網頁,看你選擇,比如“0.5%鹽酸乙醇液如何配制 分析技術討論版thank_you”

        http://www.dxy.cn/bbs/post/search?ei=UTF-8&action=Search&words=%E7%9B%90%E9%85%B8%E4%B9%99%E9%86%87&mode=phrase&bid=0&image=%E6%90%9C%E7%B4%A2

        0.5%的溶液應為重量百分比,即100g溶液中含有0.5g的鹽酸溶液。由于濃鹽酸的濃度不為100%,且乙醇溶液的密度不為1,所以樓上的配制方法得出的濃度為鹽酸乙醇溶液(1->200),而不是0.5%。

        標準的配制方法應為:取一定體積的濃鹽酸(約相當于HCl 5g,有濃度、密度,就可以計算出體積了),加乙醇至100g,搖勻,即得。

        9、微量全血培養的問題:

        問:我現在想利用微量全血培養進行染色體畸變分析,在培養時加入全血0.3ml,但培養過程中感覺有溶血現象,細胞收集后量非常少?梢蕴峁┮恍┙涷瀱?

        答:不知道你用的是什么培養基,我用1640培養,一般不溶血,加某些藥物如PHA可促使溶血.實際上溶血對實驗結果只有好處沒有壞處的,全血可以做幾個稀釋梯度1:2、1:3、1:5等。細胞收集后量應該與這個也沒有關系,一般1ml血大概只有10的6次方個細胞,還有就是細胞收集過程中容易出現問題。

        10、SKBR-3細胞培養用哪種型號的1640培養基及胎牛血清?

        答:Please check:http://www.atcc.org/

        11、langerhans細胞的培養問題:

        問:最近準備做免疫耐受方面的實驗,需要langerhans細胞培養,一直沒發現有這方面資料。請問有細胞系嗎?原代培養可行不?

        答:據所查資料顯示:langerhans細胞好象沒有現成的細胞系,一般都是原代分離培養的:

        我們實驗室的分離方法:

        (1)食管粘膜單細胞懸液制備:取距食管癌組織邊緣3cm以外的相對正常食管粘膜約3cm,用小鑷子及眼科剪鈍性分離食管粘膜上皮,并剪成約1cm2的上皮片,室溫下0.2g/L的EDTA 孵育10min,37℃,2.5g/L胰蛋白酶孵育30min,用小鑷子輕輕將上皮層撕脫,將上皮片加入含100u/ml青霉素100mg/L鏈霉素,0.8g/LDNase的Hanks平衡鹽溶液中,用眼科剪將上皮充分剪碎,用巴斯德吸管充分吹打,通過100 目鋼網過濾成單細胞懸液,臺盼藍染色證實活細胞比例大于70%。

        (2)不連續密度梯度離心液制備:首先用甲基泛影酸鈉和聚蔗糖分別配制高、低不同密度的保存液,高密度液由78.2g/L甲基泛影酸鈉與127.1g/L聚蔗糖配制而成,低密度液由44.6g/L甲基泛影酸鈉與72. 5g/L聚蔗糖配制而成。然后按高密度液與低密度液的質量比例分別為0 %∶100 %;25 %∶75 %;50 %∶50 %;75 %∶25 %;100 %∶0 % ,配制出密度為1.100、1.089、1.071、1.060、1.052g/cm3的液體。

        (3)離心:按密度由低至高的順序將配制的離心液各1ml分別緩緩加入10ml離心管,保持不同密度的液體不相互混合,不同液面之間有明顯分層。將1ml單細胞懸液(細胞數約5x106) 緩緩加入離心液上層,4000r/min離心60min。

        (4)LC判定:收集離心所得各層細胞,Hanks液洗2次,涂片,丙酮固定10min。采用鼠抗人CD1a單克隆抗體,按照免疫組化一般方法,進行免疫組化染色。胞膜呈棕黃色的為LC。

        再附上langerhans細胞的一些背景資料:

        人體langerhans’細胞(LC)來源于骨髓的樹突細胞,通過循環遷移到真皮層,然后進入真皮層。LC作為抗原提呈細胞在皮膚局部防御及介導敏感接觸反應方面起著重要作用。Langerhan spcell(LCs)主要侵犯淋巴結副皮質區,向濾泡間區、髓質區呈片狀或灶性浸潤,常見淋巴濾泡殘留,有時形成大片壞死,纖維增生似肉芽或結節狀,LCs灶有不等量嗜酸性粒細胞浸潤。根據LCs形態分以下4種類型:

        a.腎形和卵圓形核:細胞較大,胞漿豐富,分界不清,胞漿淡伊紅染或透明,核卵圓形或腎形,染色質細,核膜薄而清晰,核仁未見,核分裂象罕見。

        b.咖啡豆樣核:細胞中等大,胞漿淡伊紅染,胞界不清,核呈咖啡豆樣有深淺不一的核溝。核膜清晰b.核染色質細,核仁不易見,形似咖啡豆,核分裂象少見。

        c.混合細胞型:由咖啡豆樣細胞和大圓形細胞組成,約各占1/2,形態同b。

        d.大圓形細胞核:細胞大,核大圓形,核膜清晰,核染色質淡而細,核仁明顯,常呈嗜酸性,有1-2個小核仁,核分裂象易見,胞漿豐富淡染或空淡,亦有少數咖啡豆樣細胞,伴有巨核或多核巨細胞。

        12、有效保持細胞的原始體積的問題:

        問:我想測定細胞懸液中的細胞體積分布以及數量,由于不能當天就測,只能第二天運到較遠的實驗室去測,我把細胞泡在含有乙醇、甲醇、甲醛等混合固定劑的細胞保存液中(臨床上做液基細胞學用的)。但在測定時發現細胞體積明顯比預想的!不知是不是保存過程中細胞發生了皺縮?有什么好方法可以有效的保持細胞的原始大小(細胞活性無所謂)?

        答:以細胞懸浮液:100%ethonal,1:1。最后濃度為50%並存放於4度冰箱中,可放一周,並可測到一些蛋白活性。

        13、檢菌離心問題:

        問:檢菌實驗要幾天才出效果,我們檢過1640和FBS均三四天才混濁,難道是雙抗的作用?我們昨天做了7721傳代,過程中離心出了點問題1000r、10分效果都不是太好,但前天同樣的操作1000r5分效果就很好,是不是胰酶消化的影響,因為前天消化時把胰酶吸出了又加了hanks,昨天沒吸直接加的hanks離心,今天觀察有受菌感染的跡象。

        答:你加的Hanks是中和胰酶中含的EDTA的吧,不然也沒必要在消化后加入Hanks.你前天是消化時把胰酶吸出了,而下一次沒吸出而直接離心,那肯定在離心的過程中胰酶還在繼續作用,所以導致你離心時間的延長。

        7721這種細胞株消化時間很短,我們實驗室用0.25%和0.033%(當然濃度可以更小,文獻是0.02%)的EDTA聯合消化,加入1mL左右的消化液(鋪滿瓶底即可),消化時間一般只有30S左右,看到瓶底出現白芒芒的,并開始出現細胞針孔狀的間隙,此時就可以把胰酶吸出來,直接滴入幾滴血清轉動下瓶子終止消化,并隨后加入1640吹打,即可全部吹下,我們也沒離心除去EDTA,長的也一直很好!離心只是在你加入胰酶后消化時間久了細胞都隨胰酶液而漂下,為減少細胞損失才進行操作的,如果你掌握的好細胞是不會在胰酶作用的時候漂下來,所以也就不需要離心,減少了污染的機會!還有放入孵箱的時候要把瓶口拎緊,避免很多人拿進拿出造成污染,雖然說松一點可以利用孵箱的二氧化碳調節PH,但是7721長的很快,兩三天即可長滿,傳代操作也很即時,PH對細胞影響不大!(當然得保證你的培養基PH是正常的,最好兩個星期用完)。7721很好養,只要樓主細心操作,肯定實驗會順利開展的。

        14、葡聚糖的溶解問題:

        問:葡聚糖是用水溶嗎?我今天用水溶解葡聚糖,濃度是1mg/ml,四十度水浴,但就是不溶解,瓶底總是有顆粒狀的不溶物,不知道是什么原因?或者是我的溶劑用錯了?

        答:葡聚糖是麥芽中非淀粉質多糖的主要組成部分,其占麥芽干物質的5%~8%,是通過β(1、3)、β(1、4)糖苷鍵隨機排列的線性連接而成的。麥芽中水不溶性的β-葡聚糖主要存在于完整胚乳細胞壁中,熱水可溶性β-葡聚糖,主要存在于胚乳細胞之間和蛋白質混合在一起。β-葡聚糖在水中溶解時,濃度低時直接與水分子相互作用增加溶液粘度,濃度大時,β-葡聚糖分子自身相互作用纏繞成網狀結構,能吸收水分子形成凝膠,使溶液的粘度大大的增加。

        可以用熱水試試,不行就用1N氫氧化鈉溶解看看;0.1mol/L的就可以;也可以用PBS溶。

        15、流式細胞儀用于熒光定量的問題:

        問:目前用線粒體標記Mitotracker標記了線粒體,不知道能不能用流式細胞術來定量熒光強度,能夠反應線粒體的活性或者數量嗎?

        答:可以的,我就是用GreenFM標記線粒體數量的,用流式完全可以用平均熒光強度和峰的位置來反應。

        16、淋巴細胞分離滋養細胞的問題:

        問:我培養的是人絨毛外滋養細胞,用的是胰蛋白酶消化法,用的淋巴細胞分離液來分離,但是離心后,沒有看到灰白層。是怎么回事呢?

        答:有三個可能的原因:

        (1)胰蛋白酶消化后細胞沒吹散,最好在消化后的細胞過細胞漏網;

        (2)淋巴細胞分離液密度不對 查細胞大小/密度,調整淋巴細胞分離液密度;

        (3)溶細胞的溶液可能會對細胞分離產生影響,可用Hank''s液。

        17、細胞形態的觀測方法問題:

        問:我在鈦板上培養細胞,鈦板不透光呀,不能觀測細胞在鈦板上生長的形態。像MTT感覺只能檢測到細胞的數目。我查資料可以熒光染色用熒光顯微鏡,但是手邊沒有。用掃描電鏡吧又太貴了。

        我想細胞能不能一種方法固定住,到別的學校觀察到呢,但怎么固定才能保證細胞形態不變,又不掉下來呢,我查看資料要用酒精或戊二醛,卻不知道行不行,能不能固定?如何觀測到細胞的形態呢?

        答:呵呵,我在人工血管上檢測細胞是否黏附的方法可供參考,具體方法如下:

        (1)95%酒精固定10分鐘;

        (2)甲苯胺藍溶液浸泡30分鐘(可惜我不知道濃度,我用的是實驗室配好的);

        (3)清水漂洗殘留的甲苯胺藍溶液,這時候就可以看到黏附在上面的細胞形態了。如果你還不能確信是否為細胞,可用鑷子輕刮表面,刮得下東西的無疑就是細胞了。

        18、問:要給大鼠灌維生素a應該用什么溶劑呢?

        答:維生素A是脂溶性的物質,易溶于非極性的溶劑如:大豆油,油菜油等植物油。但是制成水溶制劑易于吸收,膽汁酸、胰脂酶、中性脂肪、維生素E及蛋白質均促進維生素A的吸收,拿普通生理鹽水、蒸餾水或糖水稀釋即可!可以加入一些表面活性劑,制成混懸型的液體制劑,這樣即克服了其溶解性,又有利于吸收。

        19、G418的配制問題:

        問:我買了GIBCO 1g的G418,聽說配制時要注意效價。上面標有725μg/mg as is basis。如果要配成100mg/ml的濃度,是不是加入7.25ml的HEPES溶液就行了?

        答:標有725μg/mg as is basis的意思是每mg粉末中的有效成分為725μg,所以,如果要配成100mg/ml的濃度,直接加入7.25ml的HEPES溶液就行了,但要注意,HEPES液的pH值,我的經驗是pH值在7.5左右最好!

        20、細胞爬片后saponin破膜問題:

        問:我想在細胞爬片后用0.1%的saponin破膜,但是我不知道破膜時間應該多久,我該怎么控制阿?我養的是肝癌細胞株,請指教。

        答:0.1%的saponin破膜,10分鐘即可。不知道你之后細胞要進行何種處理,如果還要加入抗體,則10min后吸掉或倒掉皂素時殘留一點,因為皂素打孔是瞬時效果,打開后不是一直打開哦?贵w甚至可以用皂素來配置,以保證在皂素存在時(一邊打孔一邊抗體就進入細胞)。我以前都是這么做的,效果不錯。

        21、從上海細胞庫購買細胞的問題:

        問:我3個星期前從上海細胞庫訂購了一瓶SK-BR-3細胞,但是至今沒有到,每次問都說還沒有長好,這個細胞那么難長嗎,還有大家有買過這種細胞的嗎,它寄過來的時候是用什么培養液?1640還是DMEM,用什么樣的血清呢?

        答:我從中科院上海細胞庫訂購過細胞株,應該是可信的。

        不同的細胞增殖周期不同,一般當客戶聯系訂購并將資費匯過去(一般1200RMB額外加150RMB郵費),傳真匯款單,對方收到后開始解凍細胞,傳代培養.如細胞生長快,數日張滿便用快件的形式郵寄給你.我訂購的細胞生長較慢,等了大概10天,才收到細胞.郵寄時間一般為每周三或周四,24-48h可以收到,可以在周末前收到細胞,進行消化傳代培養.

        不知你是否已將money匯了過去,如果不是,先聯系匯money;如果已經匯了,可能是因為該細胞確實生長慢,或對方解凍傳代出了問題,需要重新進行一次.關于培養條件,如果是ATCC的細胞株,上海細胞庫則完全按照ATCC的標準培養條件選用相應的培養液和血清。參見網址:http://www.atcc.org/common/catalog/numSearch/numResults.cfm?atccNum=HTB-30

        22、問:我想做一個測定紅細胞脆性的試驗,請問哪一種方法好、人的紅細胞脆性正常值是多少?

        答:紅血球脆性試驗(RBC Fragility test)是血液實驗室用以檢查貧血疾病的項目之一,特別是針對遺傳性球狀紅血球貧血。本次實驗在探討新鮮檢體之立刻反應與經37℃孵育24小時后檢體反應結果的相關性及經孵育測試的參考值,并對以不同的轉速離心做評估。結果發現經37℃孵育24小時的步驟是不可省略的,因只有如此才可篩檢出具輕微癥狀的病人;我們以25位體檢病人求得經37℃孵育24小時結果的參考值,分別是完全溶血(最大抵抗)max:0.40%-0.45%,開始溶血(最小抵抗)min:0.55%-0.6。

        23、細胞篩的使用問題:

        問:細胞篩如何使用?200目與300目區別大嗎?大鼠肺組織經細胞篩研磨后得到的是什么細胞?

        答:(1)細胞篩使用:洗干凈、但不能泡酸,可以直接用錫箔紙包好濕式消毒,使用時不能干磨,比較大的組織邊磨邊加緩沖液;

        (2)200目與300目區別在于孔的大小,一般地,做流式區別不是很大,但300目的使用時注意不能研磨過分,以免結締組織過多;

        (3)大鼠肺組織經細胞篩研磨后得到的是混合的細胞,包括肺實質細胞、基質細胞、紅細胞和少量的白細胞、NK細胞以及巨噬細胞。

        24、MTT遇到的問題:

        問:我做的是懸浮細胞的MTT,因為細胞趨向凋亡,接種密度比較高,有三種,分別是10000個/孔、100000個/孔、500000個/孔,加10微升MTT培養4小時后,用酸化異丙醇溶解結晶,但是測的吸光度都非常低,只有0.005左右,請問是什么原因呢?

        答:我也遇到過類似問題,但OD值也沒那么低,差不多0.2。開始也以為是MTT的問題,重新配置之后,仍然低,因此改用20%SDS-50%DMF做裂解液,OD值就高了,沒有進一步試驗是不是別的原因,現在一直用這種裂解液代替酸化異丙醇了。配置方法可參看下面文獻:文獻中用的是14%SDS,效果差不多。

        請點擊查看:MTT方法.pdf

        25、流式細胞周期的結果分析:

        問:我用流式檢測細胞周期變化得到如下結果:

        組別 凋亡率 細胞周期

        G0/G1 S G2/M

        對照組 0.04 78.33 11.49 10.18

        藥物1組 7.68 68.99 15.16 15.91

        DDP組 27.87 50.38 49.34 0.28

        聯合組 35.88 56.92 42.65 0.42

        誰能幫我分析一下這個結果,如果G2期出現0,是實驗失敗么?

        答:給藥時對照組與處理組細胞的狀態有沒有檢測,周期分布情況如何?如果比較一致的話你的結果可以說明DDP和聯合用藥組可以引起S期的阻滯,并引起凋亡。G2期低主要是因為細胞被阻滯在S期不能進入G2/M期,是很好的實驗結果,并不是實驗失敗。

        26、HEK 293T細胞的有關資料:

        問:我馬上就得做六組共轉染,開始選擇的是HEK 293T細胞,但因為一些問題,暫時決定換成HeLa細胞.就有關HEK 293T細胞的幾個問題請問大家:

        (1)現在我們實驗室有一個293細胞系,以前老板用來做過腺病毒包裝,請問此細胞,是否可以用來轉染;蛘,此細胞僅僅可以用做腺病毒包裝,不能表達蛋白。

        (2)看了丁香園上的很多前輩的有關293細胞的貼子,有些前輩說293細胞系各細胞株都可以轉染細胞,請問是不是這樣。

        (3)如果我們現有的不能轉染,請問用過這個細胞系的前輩是否知道這個能表達外源蛋白的293T細胞系如何得到?

        答:(1)293T由于表達大T抗原,所以可以增強帶有SV40啟動子的基因的表達,所以多用來做過表達試驗。

        (2)293細胞系各細胞株都可以轉染細胞,用鈣轉的方法就可以,轉染效率可在50%以上。

        (3)The 293T/17 cell line is a derivative of the 293T (293tsA1609neo) cell line. 293T is a highly transfectable derivative of the 293 cell line into which the temperature sensitive gene for SV40 T-antigen was inserted. 293T cells were cloned and the clones tested with the pBND and pZAP vectors to obtain a line capable of producing high titers of infectious retrovirus, 293T/17. These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.

        27、關于CHO-K1細胞穩定轉染和瞬轉COS的問題:

        問:我最近一直在瞬轉COS細胞分泌表達,上清一直沒有表達,也濃縮過再做ELISA WB,都沒有。時間挺長了,實在等不及了,就想穩定轉染cho-k1細胞系,通過MSX來篩選,加壓25UM的MSX,結果還不到兩個星期,CHO全死了,不知道怎么回事。如果有表達的話,應該是分泌表達的,但是怎么我總是做不出來呢?質粒純度和濃度都應該沒問題,到底哪里我還沒有考慮到?

        答:提三點建議:

        (1)用MSX篩選之前最好做預實驗,摸出其最小有效濃度,然后用這個濃度去篩選陽性克;

        (2)試試間斷篩選,就是篩選一周到10天,換壓力培養基為完全培養基,細胞狀態好轉后,再立刻換成壓力培養基;

        (3)在檢測蛋白水平之前,一定先在mRNA水平予以檢測,如果檢測出目的基因的轉錄,再行蛋白水平的檢測;據我的經驗,好像委托公司進行ELISA法檢測更為價廉物美。

        28、免疫磁珠分離細胞的問題:

        問:現在采用間接免疫磁珠分離干細胞的方法:

        一直采用的方法是:

        10%BSA封閉一小時,

        抗體/培養基稀釋 4度孵育半小時

        二抗磁珠/pbs稀釋 4度孵育半不時

        剛分離出的細胞狀態還可以,但是養幾天就不是很好了,考慮是否是因為操作時間太長。最近看了幾篇文獻,好像他們用磁珠分離都沒有使用封閉的過程。而是在抗體的稀釋液中加入0.1%血清。請問這樣做是否有道理?

        答:我們幾乎天天做這個,我覺得最好還是封閉好了再加一抗,不過我們封閉時間只有10分鐘,沒有必要1小時,那個太長了,本來這個過程就很多操作,不能把時間托的太長,細胞畢竟還是要善待的。封閉10分鐘的細胞吊出來之后我們養5天,都沒有問題,活的很好。

        29、問:做MTT時,monodansylcadaverine(MDC)用什么溶劑溶解比較好?

        答:無特殊,用PBS緩沖液等即可。

        30、文獻中實驗方法的問題:

        問:我最近準備做3H-TdR細胞增殖試驗,查了一些國外文獻,如下:

        1 mCi of [3H] thymidine was added for another 18 hours and proliferation assessed in triplicates. Data are representative of 3 independent experiments.是不是說:每次試驗作三個復孔,重復三次試驗呀?

        答:你的理解應該差不多。前面一句是說做三個復孔。后面一句說,重復做了三次實驗,采用的數據是三次當中比較典型的一次。

        31、24孔板里293細胞轉染問題:

        問:我在24孔板里做293細胞的轉染,轉染試劑是Invitrogen的Lipofectamine2000。奇怪的是,每次加完DNA-Lipofectamine complex,24個孔當中的后面幾個孔(比如最后6個孔)里的細胞就明顯有一部分死亡,死亡率是10-30%,通常最嚴重的是最后兩個孔。但是前面的孔里的細胞總是沒有問題。用不同的DNA做實驗,都發生同樣的問題,就是總是后面的孔里細胞死亡,而前面的孔里細胞沒問題。是怎么回事呢?

        答:我也遇到過類似的情況,如果你在加DNA-Lipofectamine complex時孔板里是沒有液體的,會在風機下風干的,很快的,這樣你在加到后面的孔時,部分細胞已經干了,所以你先加的很好,后面的就有問題。解決辦法就是,你不要一起吸凈所有孔的液體,6個孔為一個單位,吸棄孔里的液體,在加DNA-Lipofectamine complex,就可以了。

        32、成骨細胞消化后不貼壁的問題:

        問:我養的是成骨細胞,消化總是存在著問題,以前是用1ml左右胰酶消化一會兒,再棄去大部分留少量繼續消化,但是發現總是培養瓶的四周的細胞消化的很快都漂了起來,可是中間的還沒太消化好,這個時候一吹打就有好多細胞吹打不下來,24小時后觀察,發現有好多懸浮的細胞沒有貼壁,我分析可能是吹打的時候細胞受了損傷,還有那些先消化下來的細胞胰酶作用時間太長了,后來我再消化時就增加了胰酶的量基本覆蓋平底0.5-0.6ml,這回消化的程度很同步,吹打也比較容易,但是兩天后觀察,同樣也有很多細胞沒有貼壁,這是為什么呢?加的胰酶要倒掉嗎,我沒有倒,直接加了培養液(含10%血清)吹打。

        答:先加入少量胰酶0.5-1ml左右使其在所有細胞上流過,倒掉,去除漂浮的死細胞,然后加入0.5ml左右胰酶,傾斜幾次培養瓶,使胰酶在細胞上層來回的走幾次,使所有的細胞都能在幾乎同一時間接觸到胰酶。然后消化到手動瓶子就有細胞脫落時加入培養液,吹至均勻分散。

        33、培養骨髓基質干細胞的問題:

        問:我抽提的兔骨髓細胞(欲分離骨髓基質干細胞)原代培養的時候。細胞總是生長得不理想,連分瓶都無法實現,我用的是DMEM培養基,是微環境模仿的不對還是什么原因呢?

        答:兔骨髓MSC的分離:取成年新西蘭兔用3%戊巴比妥鈉按1mg/kg的劑量施以全身麻醉,另用1%利多卡因于手術部位施以局麻;無菌操作下于右脛骨上端內側部用銳性穿刺錐于骨皮質上開出一直徑約2-3mm的孔,使通達髓腔;用18號硬膜外穿刺針接5ml注射器,內含3000U/ml的肝素0.1ml,沿骨皮質上的孔穿入髓腔,抽出骨髓血約2ml;抽出的骨髓血用平衡液洗滌兩次后,離心180xg,5min;棄去上清液,沉淀用Ham f12-10%FBS培養液重新打勻;用滅菌的0.17mol/L飽和NH4Cl溶液按1∶5的體積比加入已重新打勻的懸液中,4℃下保留10min,取出再離心180xg,5min;棄去上清后,以幾滴平衡液再懸浮后,用細胞計數板作細胞計數,確認有核骨髓細胞量達106-107后,即可進行原代培養接種用。

        34、問:做膀胱癌脫落細胞FISH,怎樣處理收集到的尿液標本?

        答:我曾做過尿液細胞培養,以收集患者晨起第一次尿,因為經過一夜尿液濃縮,有形成分最多!以無菌中段尿的標準用無菌離心管收集,若不能很快實驗,可短暫保存在4度冰箱內,最好不要超過一個小時!收集后快速離心,超凈臺下培養液重懸尿沉渣,接種培養瓶即可!如果你不需要培養,而僅僅是拿細胞直接做,就直接做細胞涂片了,當然有甩片機更好了!做涂片離心后可用PBS重懸洗兩到三遍,再細胞涂片!尿液量大于300ml,請先離心最后剩下50-100ml并加入等量100%酒精,最后濃度為50%放置4度崩相中,可保存一周。

        35、細胞培養箱的HEPA filter培養問題:

        問:默認的是6個月,如果已經提示要換HEPA filter了,是不是就必須馬上換,一個星期后再換會怎么樣嗎?HEPA filter最長可用多久?一般多久才換新的?

        答:如果你的培養箱中的細胞沒有發生頻繁的無緣無故的大范圍的細菌污染事件,那你的HEPA就可以繼續用;如果只是發生了小范圍的污染事件而用75%的酒精擦拭后就遏制這種現象,你也可以不用換。HEPA其實就是一張折成β折疊后的慮紙放在圓盤狀的物品中的慮器。我們實驗室的HEPA我曾換過。不過若是你們的money充足,也可以一年一換(EPA百樂好像賣1000塊一個)。

        36、問:外周血單核、巨噬細胞的分離和培養方法。

        答:以前認為紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等都是分化終末細胞。很難在體外培養生長或僅能短期培養而不能傳代,但是近來技術的發展,有血細胞培養純化的報道。血細胞可從外周血中用梯度離心法獲得,也可從脾臟中用機械法切碎過篩分離獲得(尤其是淋巴細胞)。從腹腔沖洗可獲得較多的巨噬細胞。也可從骨髓中取前體血細胞,然后加上促進單核/巨噬細胞分化和生長的細胞因子,從而誘導前體血細胞向所要的細胞方向分化。

        37、SP2/0細胞周圍有黑色和亮的小點的問題:

        問:我昨天收到的SP2/0細胞,剛收到的時候還觀察到有貼壁的細胞,將多余的營養液吸出后放入培養箱培養,今天觀察細胞都是懸浮的,雖然部分細胞還是比較圓比較亮,但大多為單個分布,而且細胞周圍有很多黑色的和亮的小點,黑色的我估計是死亡的細胞碎片,那亮的是什么呢?是不是污染哦?我將三瓶細胞分開操作的,不會都污染了吧?還有請問各位細胞經過長途運輸(3天)后一般要幾天才能恢復開始生長?

        答:sp2/0細胞還是比較好養的,一般兩到三天就能恢復活力開始生長了。建議你800轉離心后換瓶培養就可以除去那些黑點了。亮點應該不是污染,我原來養時也出現過,沒有什么影響,若是看著心煩,就離心換新瓶吧。

        38、問:非洲綠猴腎CV-1細胞,字母C、V分別代表什么?

        答:cv=curriculum vitae

        細胞名稱: CV-1(M)

        供體:非洲綠猴腎

        細胞形態:MV1LU

        特性:豹肺上皮細胞

        建立者和年代:Fogh和Luncl 1956年

        資料來源:http://210.34.120.10/software/07/10/001/01/00001/cells/cell_42.htm

        39、問:sp2/0細胞的外觀現象問題:

        問:細胞是從別人實驗室拿過來養的,拿來的時候狀態很差,細胞不圓滑透亮邊緣有褶皺,傳代的時候扔掉大部分細胞,留下一點培養,7天后發現細胞變圓,今天發現剛從培養箱拿出來的時候,鏡下觀察發現細胞狀態很好,但是1分鐘后細胞開始變皺,請大家幫忙分析一下是什么原因?是否是因為狀態本身不好,溫度變化對它影響很大?

        答:你把細胞從37度的環境中拿到室溫,總要給細胞一個適應環境溫度變化的過程吧!你所說的這個現象是正常的。就是人在夏天的時候從海南到哈爾濱也要有個適應的過程嘛!剛從37度拿出來的時候,細胞狀態的確很好,你說的在室溫下放置1分鐘以后細胞就不圓了,其實再過一會,等細胞適應了室溫,狀態就應該恢復了。假如過一會還是不行,那就是細胞自身的狀態問題了。

        40、問:s180細胞是貼壁生長的嗎?

        答:(1)s180細胞是貼壁生長的;

        (2)通常情況下S180由昆明小鼠腹水傳代。小鼠腹腔接種1.0x10 5 個S180細胞后第10天,無菌條件下抽取腹水,用PBS稀釋后計數,腹腔接種傳代。

        另外,可以從ATCC上可以查到。

        41、問:Lewis鼠源性肺腺癌細胞(LLC)的來源是什么?

        答:C57小鼠:This line is widely used as a model for metastasis and is useful for studying the mechanisms of cancer chemotherapeutic agents.

        Lewis lung carcinoma is a cell line established from the lung of a C57BL mouse bearing a tumor resulting from an implantation of primary Lewis lung carcinoma.

        The cells are reported to be highly tumorigenic, but weakly metastatic in mice.

        如果還不詳細的話請查閱這篇文獻:

        Establishment of a cloned line of Lewis lung carcinoma cells adapted to cell culture. Cancer Lett. 11: 63-73, 1980. PubMed: 7226139。是LLC起源的文章。

        42、測定細胞的蛋白含量問題:

        問:利用大鼠胚胎細胞做藥物的攝取實驗后,需要根據細胞在每個孔內的量的多少來分析其對藥物的攝取情況。而蛋白量可以反映細胞量。有什么好的方法來測定細胞的蛋白量?

        答:細胞總蛋白質含量測定廣泛用于細胞生長實驗以及用作表示酶,受體及細胞外代謝產物特異性活性的度量單位,蛋白質含量測定最常用的方法是Lowry''s法和考馬斯亮藍測定法,后者比前者更敏感,細胞用量少,50-10000個細胞即可。具體方法請查閱司徒鎮強編寫的細胞培養P188-189。

        43、細胞三維培養的膠原問題:

        問:正在做細胞的三維培養,用的是BD公司的I型膠原和matrix gel膠,但怎么不凝?

        買的I型膠原是已經溶解在醋酸溶液中的,無菌包裝,3.45MG/ML,按照說明書的提示加了0.023倍體積的氫氧化鈉中和,然后補加培養基至膠原終濃度為2.5MG/ML,和細胞沉淀混勻后,置于做好的模型內, 室溫下10分鐘,37度培養箱內 三個小時后,再加6ML培養基,但二十四小時了,膠仍不凝,有的已經散開了,請問我哪個地方做錯了?是氫氧化鈉的體積不對么?膠凝了以后應該是白色不透明? 二十四小時是不是就應該凝了?如果錯了,是錯在哪里了?

        答:沒有用過BD公司的膠原,但使用過Sigma的I型膠原(固體),一般是自己配制成液態,然后根據需要按一定比例添加10x濃縮培養基及血清(保證細胞的營養),用1M濃度的NaOH調節pH值約7.2,再和細胞混合均勻后添加到培養器皿中,直接放到37度培養箱,一般也就是30分鐘左右即可凝固,等完全凝固后,再在其上添加培養基。膠凝固后,由于其內添加了培養基,所以一般是粉色的。

        另外,你在添加NaOH及培養基后,測沒測過膠原的pH值?再者會不會在膠原中添加培養基量太多?培養基占的比例大,也會影響到膠原凝固。

        44、不同細胞siRNA轉染效率的檢測問題:

        問:(1)最近在做RNAi,用的siRNA,然后Real-Time PCR,發現抑制率僅20-30%左右,與說明書說的70-90%相去甚遠,咨詢相關人員后,認為可能是轉染效率的問題,如果轉染效率僅有20-30%,那抑制20-30%也就不少了。因此想請教一下,一般不同細胞通常轉染效率是多少?我用的是MT4(懸浮)、CEM(懸浮)、HepG2(貼壁)聽說懸浮細胞轉染效率要低,原代更低,貼壁好一些,是否如此?

        另外就是siRNA的轉染如何確定轉染效率?有人建議加上熒光,但是已經定了,好幾千塊錢,再定也不好;或者陰性對照加上熒光,那樣的話如何檢測?還有建議用個陽性對照,找個別人都做得很好的,抑制率很明確的基因來做個RNAi,再與自己的比較,有好的建議嗎?

        答:通常情況下懸浮細胞轉染效率較低,貼壁細胞的轉染效率因細胞不同,有些很高有些很低。HepG2的DNA轉染效率大概有50%,siRNA暫時沒做過。如果你有GFP質粒和針對GFP的siRNA共轉染,用只轉染GFP質粒的孔做對照,可以看出轉染效率。如果沒有針對GFP的siRNA就只能轉染GFP質粒,一般情況下轉染DNA好的話,轉染siRNA也不會差的。個人覺得細胞本身的性質決定了轉染效率。

        問:(2)針對GFP的siRNA是不是在設計siRNA時就將GFP的表達序列設計進去?

        答:不是的。針對GFP的siRNA和我們通常用的化學合成的siRNA一樣,只不過是針對GFP基因的。

        45、轉染RNA i時的問題:

        問:我在轉染RNA i時不小心加了雙倍的RNA(相對說明書),請問會有什么影響?因為還有后續實驗,所以在這求助,能不能繼續做下去呢?另外invitrogen的stealth siRNA在細胞培液中能作用多久呢?可達到一周么?

        答:我的實驗合成的siRNA的使用說明:siRNA的工作濃度一般是10-100nM,我準備用50nM做轉染。相同的孔板中,不同的量的siRNA加的轉染試劑的量是相同的,所以我覺得不存在質粒DNA轉染時與轉染試劑的比例不同影響轉染效率的問題。如果你的siRNA能有效干擾你的目的蛋白的表達,加的量越大應該沉默效果越好.只是合成的siRNA比較貴,多加多花費。合成的siRNA體外瞬時轉染,干擾效果大致能維持2-5天左右。

        46、克隆形成試驗的問題:

        問:我的試驗是關于放療增敏的,可實驗室沒人做過這方面的試驗,沒辦法,有個師姐建議我在丁香園向大家求教,我想做克隆形成試驗,我看了一些資料,根據放療劑量不同,每個培養皿接種的細胞數不一樣,我覺得用培養皿污染的可能性很大,所以想用6孔板,如果放療劑量為2Gy 4Gy 6Gy 8Gy 10Gy,那么每孔應該接種多少細胞啊,我看了一篇文章,作者是先將細胞接種到100mm培養皿,24小時后加藥,再作用24小時,然后拿去放療,之后將細胞消化,臺盼蘭染色,計數活細胞,然后再接種到60mm培養皿,我覺得每消化一次就是對細胞的損傷,可不可以接種前就計數活細胞,放療后直接放在孵箱培養,這樣的誤差明顯嗎?另外,我想問問在此計數活細胞的目的是什么?

        答:做克隆形成實驗首先需要在平皿或孔板中接種相同數量的處理過的細胞,所以需要計數細胞后再種于平皿或孔板中。如果在放療之前就接種細胞,則經過放療后,就不能保證成活的細胞數量是相同的,因而在計算克隆形成率時分母則不一致。而計數活細胞的目的是為了將經過放療后已經死亡的細胞過濾掉,只計數活細胞,將活細胞種于平皿或孔板中。經過大概兩周的時間,觀察細胞的克隆形成情況,克隆形成超過50個的計為一個克隆,計數不同處理的細胞可克隆形成個數,從而得到不同放療劑量對細胞的影響程度。

        47、貼壁細胞怎么做transwell小室侵襲實驗?

        問:我是用7901胃癌,用那種塑料的,就一個大孔的那種transwell。請問怎么做呢?

        答:貼壁的胃癌7901細胞作起來更簡單啊,只要你的材料齊全質量好就可以。

        材料:侵襲小室(TranswellChanber 孔徑8um),人工基質膠(Matrigel)

        具體方法:設置加藥感染7901胃癌細胞實驗組及空白細胞對照組,24h后收取細胞進行實驗。同時將Matrigel 40μl均勻的鋪在TranswellChanber膜上,37℃ 30min成膠。取對照組和實驗組細胞各2x105/ml 0.3ml分別接種到成膠的TranswellChanber,并將TranswellChanber置于24孔板內,板內加入0.6ml含10%小牛血清的1640培養液,24h后取出TranswellChanbe;用棉簽頭擦掉Matrige膠及膠上細胞,PBS液洗3次,瑞氏染色。

        結果判定:200倍光鏡下隨機計數5個視野的穿膜細胞數,取均值。實驗重復3次。

        48、細胞復蘇后形態不均一的問題:

        問:復蘇了u937后,發現數量很多與正常u937細胞形態相似,但是體積卻大了2-3倍的“細胞”,是出了什么問題呢?

        答:人白血病細胞u937生長比較慢,血清濃度要求比較高,一般要用含10%-15%胎牛血清的RPMI1640培養液來培養,因此建議凍存時應加大血清的量,復蘇時才能得到高存活率的細胞。另外,DMSO也應選擇質量好一些的,否則會影響細胞的生存質量.體積卻大了2-3倍,可能由于:

        (1)細胞由于凍存液效果不佳,影響了復蘇后的細胞生長狀態;

        (2)由于凍存條件不穩定,如低溫冰箱或是液氮的溫度變化而影響了細胞發生變;

        (3)由于凍存時細胞發生交叉污染,致使細胞在凍存復蘇后發生突變;

        (4)也可能由于細胞剛剛復蘇,不很適應,比較脆弱,而造成細胞突變,建議加大血清,繼續培養觀察一段時間。

        49、問:雞胚內臟培養后會形成什么細胞?

        答:如果用的是胰酶消化,還是用做成纖維細胞的培養基,那么多數還是成纖維細胞。因為這樣的條件下成纖維細胞具有生長優勢。其生長速度快,所以是優勢細胞。但是如果你換用其它酶消化,得到的細胞可能是別的細胞,而非CEF。

        50、關于hepG2細胞的問題:

        問:(1)我現在剛剛開始嘗試養HepG2 長得挺快, 貼壁也很好?删褪前|里貌似有小顆粒,是細胞的顯微結構呢 還是細胞狀態不好的表現呢?另外,給有經驗的師姐看了我的HepG2,師姐稱贊背景比較干凈。但是形態更像星狀細胞不像HepG2。

        答:HepG2是腫瘤細胞,屬于多核細胞,你看到有很多的小黑色顆粒,在細胞內部的很可能是細胞核,在細胞與細胞間質之間如果靜止不動很可能是腫瘤細胞正常的黑色素分泌物,如果動的話很可能是黑膠蟲污染,黑膠蟲污染短時間不會影響細胞生長狀態,但當細胞生長狀態略差或是細胞剛剛傳代后會影響到細胞的生長,建議再觀察一段時間,具體情況再具體分析. 若是背景比較干凈那應該不是黑膠蟲污染,細胞形態呈星狀可能由于細胞營養不良,所以呈觸角狀生長,建議加大血清用量,用同一種培養基再繼續培養觀察一段時間。

        問:(2)我養的SH-SY5Y是多核細胞嗎?它是神經母細胞瘤,好像分化比較高,保留了很多神經元的特性。我看到我的細胞里也有小黑顆粒,靜止不動,不是黑交蟲,調焦距變亮。我的細胞成錐形或三角形,黑色顆粒在角上,不知道屬于金色太陽說的哪一種?還是什么細胞器呢?還是血清不好?或者是其他情況?

        答:SH-SY5Y人骨髓神經母細胞瘤也是屬于多核細胞。你看到的小黑顆粒有可能是細胞核,另外小黑顆粒還有一種可能就是由于血清的原因,經驗認為:國產血清容易發生黑色素的沉積,而且當血清從-20℃中拿出溶解使用時,最好要按照-20℃——-4℃——室溫的過程一步一步來,不要急于速溶,否則細胞間質中很容易產生黑色物質,建議用56℃滅活的10%進口胎牛血清,胰酶消化濃度稍低些,繼續觀察培養,如果小黑顆粒沒有影響細胞生長狀態也沒就什么大礙了!

        51、關于明膠緩沖液的問題:

        問:今天購買的sigma公司的c5a,上面說稀釋時要在緩沖液里加入明膠,想請問下明膠緩沖液有哪些呢,怎么配置啊(明膠好像不溶于水,加熱溶解后會不會再析出?),哪種明膠緩沖液可以作用于細胞啊,有沒有pbs明膠緩沖液呢?

        答:我們用明膠的目的也一樣,主要用于處理細胞培養皿底,幫助原代EC細胞貼壁,配置時使用pbs,高壓后融解,4度放置后凝成膠狀,37度復溫后可溶解使用,但時間久后,反復高壓回影響使用效果。

        52、COC1細胞的問題:

        問:我的COC1細胞已經復蘇兩個星期了,細胞是活的,卻不增殖,不分裂,哪位好心人可以指點一下嗎?是什么原因?

        答:是否細胞密度太低了,細胞是密度依賴型的,在密度太低的情況下增殖會非常緩慢?蓢L試增加血清濃度到20%,或者將細胞消化吹打一次加新鮮培養液培養。

        53、離心丟失大量細胞的問題: 問:我分離胚胎小鼠的胰腺,然后膠原酶消化成單個的細胞,離心前細胞大約為1x106,可是1500rpm(大約400g),離心10min后,細胞竟然丟失一半。而且離心后細胞容易聚集在一起,不太容易形成單個細胞,是因為部分細胞死亡了嗎?我的實驗要求大量的細胞,細胞數要準確。提高離心力對細胞不好,降低離心力又損失細胞,請問有沒有好辦法解決?

        答:離心1500rpm(大約400g)?離心力是否偏大?一般離心細胞的離心力要求低于200g。如此大的離心力,丟失細胞的可能性不大,你的細胞離心后容易聚集在一起,也是這個原因。你的細胞離心后丟失一半,是細胞計數了嗎?有沒臺盼藍染色計數活細胞比例?下次建議將上清也觀察一下,看是否有活細胞存在!個人認為當前細胞丟失可能是因為離心力過大導致細胞死亡所致。至于如何在保證足夠的細胞數和細胞正;盍χg選擇?個人認為還是應該首先保證細胞活力的正常,這就要求離心力不能超過200g。至于如何在滿足這個離心條件下更多的沉積細胞,就要再請人不吝賜教了。

        問:(2)昨天又試了一次,離心前細胞大約為1.3x106,1100rpm(大約220g),離心10min,因為我需要細胞很大的密度,所以我僅僅加入100μl培養基在離心管的底部。細胞竟然只剩下0.5x106。我的細胞丟失是否因為很多細胞粘在離心管壁上沒有沉到底端?

        答:你用的是15mL的離心管來離心的細胞嗎?只用了100uL的懸液?離心完后需要棄去上清嗎?如何棄的上清?如此較大的細胞密度、微量(100μL)的體積在移取和計數時應該誤差會很大吧?!可能細胞在轉移的過程中粘在移液器或離心管壁上了造成了丟失。1100rpm(大約220g),離心10min應該可以將細胞離心下來的。

        問:(3)我以前用的是1.5ml的EP管及離心半徑只有6.5cm的小離心機, 肉眼發現很多細胞是粘在管壁上的,而沒有沉到管底。后改用15mL的離心管及大離心機,肉眼沒發現細胞粘在管壁上。

        這次我用15mL的離心管1100rpm(大約220g),離心10min,上清我是用1ml的槍輕輕吸走的,剩下大約100μl來重懸細胞,然后取5μl稀釋20倍記數的。 我把上清轉移到小培養皿中,在鏡下觀察有不少細胞, 然后我把上清1500rpm(400g),離心10min。有少量沉淀。再次把上清轉移到小培養皿中,在鏡下觀察還有細胞。不知道是用小離心機還是大離心機好? 也許細胞在轉移上清的過程中丟失了。但是不應該丟失這么多呀?

        答:有個問題很重要:消化下來細胞后,細胞是否還是在消化液中來離心?消化酶消化下細胞后,移入15ml標準離心管,立刻加入適量PBS或培養液(3-5倍消化酶)稀釋,終止消化酶的作用,消化酶長時間的作用會導致細胞脆性增加,抗機械損傷能力下降甚至死亡。如果沒有注意這個細節,可能是導致細胞丟失的主要原因。關于離心的問題,個人的經驗是,轉數在800-1000rpm,時間5min足夠。一般不需要超過1000rpm,時間也不需要太久,一是可以減少細胞的機械損傷和在室外的時間,另外,這樣的轉數和時間可以保證細胞沉淀的前提下,沉淀細胞的緊密度適當,吸除上清后加入適量培養液,稍加吹打即可分散懸浮。最后關于計數的問題,不知是否使用計數板計數。1ml液體里計數100萬細胞,計數即是平均100個細胞/大格,誤差較大,20-30個細胞/大格較適宜,即20-30萬/ml(加PBS稀釋成5ml后混勻再計數較好)。至于離心后100μl重懸再計數更不可以,如細胞數不丟失,即是100萬/100μl,計數板上是1000個細胞/大格,根本沒法數出來!如果一定還要數,建議5ml PBS重懸后計數,再離心后100μl消化液重懸(不需再數),實驗用。

        54、ho/PI雙染檢測貼壁細胞的問題: 問:請問用ho/PI雙染檢測貼壁細胞,直接在孔版中加染色液,請問加染色液之前是否需要吸出培養液呢?

        答:需要吸出培養液。用PBS洗2次后再加入染料。Ho染色30-45min,PI染色5-10min左右。PBS洗后可以上機觀察。

        55、GFP標記的樣品的固定與封片問題:

        問:我要用激光共聚焦顯微鏡觀察帶有GFP標簽的酵母細胞,但是不知道用什么方法固定與封片,有資料說可以用低濃度的多聚甲醛,盡可能短時期地固定(對于細胞約5-10分鐘)。標本可以放在甘油封片劑中(約含90%的甘油)。想請教各位達人這個方法可行嗎,哪位高人能提供具體詳細的固定于封片方法可真就是在趕集不過了。

        另外,如果要是用酵母細胞作FRAP的話,如何制備活細胞的涂片呢?

        答:4%多聚甲醛,20-50%的甘油緩沖液封片就可以了,有條件也可以買專門的熒光封片劑的。

        56、H2O2誘導細胞凋亡局部細胞大片漂浮問題:

        問:是大片漂浮,感覺是一下不貼壁似的,就跟吹下來似的,但我并沒有吹,是在瓶里養的,剛加入H2O2還沒有,過大概幾小時就大片漂了,是什么原因呢?我知道高濃度會漂,可我用低的濃度0.04mM也漂,是怎么回事呢?

        答:細胞漂浮我認為主要有兩種原因,一就是你所說的,H2O2濃度太大導致細胞的大量、迅速的死亡;還有一個原因是你的細胞密度太高,這樣細胞抓壁不牢,在外界刺激下也很容易成片脫落。第一種情況你可以通過設定一定的H2O2濃度梯度來篩選,第二種情況則適當降低細胞密度,一定不要讓細胞長得過滿。

        57、外周血白細胞的培養問題:

        問:想要培養雞外周血白細胞,采集外周血分離得到白細胞,如何進行培養?培養液用1640可以嗎?一般能存活多少天?是不是還要加別的細胞因子?比如IL-2?

        答:分離得到白細胞計數后懸浮到1640完全培養基,一般情況下,不加其它物質,細胞可以生長五天,或更長的時間,培養五天以上細胞表面標志會有一定變化。如果要培養更長的時間就需要加IL-2,可以培養一個月。

        58、如何使細胞懸浮的問題:

        問:我現在做一個實驗使一個成纖維細胞和一個卵母細胞粘附在一起,把消化的細胞放在皿里的時候一會細胞就會粘附在皿底部了,粘不了幾個成纖維細胞就貼壁了,我想問加什么試劑如何減緩細胞貼壁?或者是怎么樣不讓細胞很快貼壁?

        答:我建議你參考胚胎干細胞制作擬胚體時的方法,為使細胞懸浮,可將消化后的細胞接種到細菌培養皿中,皿底經過處理細胞不會貼壁,千萬不要用細胞培養皿!我們實驗室都是這樣做懸浮培養的,應該沒問題的。

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